Article

Real-time RT-PCR high-resolution melting curve analysis to detect and differentiate Brazilian variants of grapevine viruses

Análise das curvas de dissociação de alta resolução de RT-PCR em tempo real para detetar e diferenciar variantes Brasileiras de vírus da videira

¹ Embrapa Uva e Vinho, Rua Livramento, 515, Bento Gonçalves, RS, 95701-008, Brazil
² Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Estadual do Rio Grande do Sul, Rua Benjamin Constant, 229, Bento Gonçalves, RS, 95700-346, Brazil

^* Corresponding author: Tel +55 54 34558000; e-mail: thor.fajardo@embrapa.br

Received: 18 April 2023
Accepted: 17 July 2023

Abstract

Detecting and identifying viral infections in perennial plants, such as grapevines, can be challenging. Therefore, the aim of this study was to perform a real-time RT-PCR (RT-qPCR) high-resolution melting (HRM) curve analysis to detect and differentiate Brazilian variants of grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) and grapevine fanleaf virus (GFLV) in 74 and 10 infected plants, respectively, maintained in a collection block of grapevines. A single amplification curve was generated for each sample by RT-qPCR. Considering the amplified region of genomes of these two viruses, it was possible to identify and distinguish different variants of GLRaV-3 and of GFLV, which showed significantly different melting temperature (Tm) values between themselves, reflecting differences in the nucleotide sequences of the respective amplicons, and allowing discriminating variants and assess the viral diversity in grapevine accessions. The HRM analysis was validated by sequencing and nucleotide comparisons among Brazilian isolates of GLRaV-3 and GFLV.

Resumo

Detectar e identificar infecções virais em plantas perenes, como videiras, pode ser um desafio. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar uma análise da curva de dissociação de alta resolução (HRM) por RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) para detectar e diferenciar variantes do vírus do enrolamento foliar tipo 3 (GLRaV-3) e do vírus do urticado ou nó-curto (GFLV) em 74 e 10 plantas infetadas, respectivamente, mantidas em blocos de coleções de videiras. Uma única curva de amplificação foi gerada para cada amostra por RT-qPCR. Considerando a região amplificada dos genomas dos dois vírus, foi possível identificar diferentes variantes de GLRaV-3 e GFLV, que apresentaram valores de temperatura de dissociação (Tm) significamente diferentes entre si, refletindo diferenças nas sequências de nucleotídeos dos respectivos DNA amplificados e, assim, constituindo uma forma simplificada de diferenciar variantes e avaliar a diversidade viral em acessos de videiras. A análise de HRM foi validada pelo sequenciamento e comparação de nucleotídeos de isolados brasileiros de GLRaV-3 e GFLV.